骨髓原始间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）是骨髓基质干细胞，是在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。可在体外分化为内、中、外3个胚层来源组织的细胞，如：骨、软骨、肌腱、脂肪、肝、肾、皮肤肌肉、神经等10余种成熟细胞。由于其来源充足取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，BMSCs在干细胞移植和基因治疗等方面引起广泛重视。
常见分离方法目前BMSCs的分离方法主要有:
?贴壁培养法：根据BMSCs的粘附特性来实现分离贴壁的方法；
?密度梯度离心法：根据BMSCs与其他细胞的密度不同来分离的方法；
?流式细胞仪分离法：根据细胞大小或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离的方法。
密度梯度离心法与流失细胞仪分离法价格昂贵且操作复杂、容易导致细胞大量流失，应用相对较少。贴壁培养法应用最早，具有操作简单，对细胞干扰少，不易发生污染等特点较为广泛应用，其缺点是细胞纯度较低，但有关研究表明，BMSCs细胞扩增到P1、P2代后细胞的纯度分别可达到95%、98%。下面将介绍用贴壁培养法分离BMSCs。
实验材料准备4-6周龄SD大鼠；手术器械；培养瓶/皿；大鼠骨髓间充质干细胞完全培养基（DMEM-F12，10%胎牛血清，间充质干细胞生长添加剂，青霉素U/mL，链霉素ug/mL）；超净工作台；1mL注射器；胰蛋白酶；磷酸缓冲液；37℃、5%CO2饱和90%湿度的培养箱。
实验步骤1SD大鼠麻醉处死，75%酒精的容器中，消毒5分钟；
2超净台下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在含2%双抗的PBS中；用手术刀片将股骨及胫骨上附着的肌肉组织剔除干净，整个过程要保持无菌操作；
3用线剪剪除骨干两端骨骺，显露髓腔，用1mL注射器吸取1mL含双抗的细胞培养基，用针头插到骨的一端冲洗，然后换另一端冲洗，反复冲洗髓腔，直至骨髓内的所有骨髓液冲洗干净。收集髓腔冲洗液后将所提取的细胞悬液轻轻吹打混匀；
4将骨髓单细胞悬液，以rpm离心5分钟，弃上清，红细胞裂解液裂解细胞，离心弃上清，去除红细胞碎片将细胞悬液；
5用1mL培养基重悬骨髓细胞，计数。根据计数情况制备细胞悬液，一般接种密度保持在6-8×/mL，接种到10cm培养皿中，置于37℃、5%CO2饱和90%湿度的培养箱培养；
648h后进行换液去除未贴壁的细胞，2-3d换液一次，直至细胞达到80%-90%融合时，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化后按照1：3比例传代，记为P1。传代后每2-3d换液一次，细胞达到基本融合后可继续传代。
小贴士
BMSCs在培养的1-3天细胞生长比较缓慢，之后会迅速增殖，第7-10天达到融合。用贴壁培养法分离的BMSCs细胞一般在P3-P4时细胞纯度较高，部分细胞P5开始出现细胞呈宽大扁平状，增殖速度减慢等衰老迹象。因此用BMSCs开展后续实验时尽量选择P3和P4的BMSCs。
END
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