7月13日实验操作：小鼠骨髓细胞获取1.前期准备2.动物处死和骨髓细胞冲出3.骨髓细胞重悬（细胞间操作）疑问1.红细胞裂解液RedBloodCellLysisBuffer（1）原理（2）成分（3）配制步骤（4）保存
实验操作：小鼠骨髓细胞获取1.前期准备（1）烧杯内一半75%酒精，或50ml的离心管内装一半
（2）泡沫盖（喷酒精，上铺薄膜手套，手套上喷酒精）
（3）6孔板，左边2孔及右下孔加入3mlRPMI-培养基，右上孔加5ml（如下图所示）
（4）各孔分别加入1%双抗（链青霉素）
3mlRPMI-+1%双抗+剔除肌肉并分离的股骨和胫骨5mlRPMI-+1%双+冲洗所得细胞悬液3mlRPMI-+1%双抗+初次取出的腿骨3mlRPMI-+1%双抗2.动物处死和骨髓细胞冲出（1）雌性或雄性C57BL小鼠（6到8周）颈椎脱臼处死（按住鼠头，90°拉鼠尾），放入75%酒精烧杯或离心管内浸泡约1min后取出
（2）大腿处环切其皮肤，将皮褪至脚踝，将部分大腿肌肉剪除，漏出股骨转子，活动其关节，确定股骨转子位置，将股骨头从关节窝处剪出，剪断脚踝，小心剔除多余肌肉及筋膜，放入培养皿左下孔，再小心剔除多余肌肉及筋膜，注意不要剪掉骨松质，放入上左上孔培养基处，另一后腿进行同样操作。
（3）将左上孔内的腿骨仔细剔除至无肌肉组织，从膝关节处剪断使其分为股骨和胫骨，注意不要剪断骨松质，放入左上孔，进行另一根腿骨操作。
（4）将腿骨取出，稍微剪去部分骨骺段，抽取右上孔培养基（5ml孔），往腿骨注射，先轻推，当有液体冲出时再用力推出（尽量不要使液体从上方溢出），将骨髓细胞冲入培养皿，重复多次至骨头变白。
3.骨髓细胞重悬（细胞间操作）（1）前期准备：15ml离心管，1ml红细胞裂解液，PBS细胞裂解液，配置培养基：含GREM双抗mGM-CSF的培养基）
（2）将细胞悬液转移至15ml无菌离心管，于细胞间操作，rpm离心5min，弃上清
（3）提前准备好PBS溶液，加入1ml红细胞裂解液（NH3Cl）重悬细胞，室温孵育1min
（4）加入10mlPBS中和裂解液，rpm离心5min，弃上清
（5）加入含1%双抗的10%胎牛血清（德国GREMFBS）的培养基重悬细胞（4ml），进行细胞计数（用培养基PBS稀释10倍（μl+20μl），取10μl冲池），约4-5x/鼠。
（6）取培养皿（若DC则取细菌培养皿，无螺纹，减少细胞贴壁），每皿加入2x细胞/10ml，加入mGM-CSF（1个PRC管每50ml管），37℃，5%CO2培养。
（7）以下部分暂时未进行操作
（8）第三天，往培养皿加入10ml含20ng/mlrmGM-CSF培养基。
（9）第六天半换液，将皿倾斜，吸取上部分培养基10ml，加入上步培养基10mlor收集旧培养液10ml，离心，弃上清，用上步培养基重悬后加入原皿。
（10）第八天收集细胞，用移液器轻轻吹打收集悬浮DC，xg室温离心5min，弃上清，用10ml完全培养基重悬，然后进行实验铺板。
疑问1.红细胞裂解液RedBloodCellLysisBuffer（1）原理氨根离子不能透过细胞膜，而其他离子可以，这样会造成细胞内部的离子浓度高于外部溶液内的离子浓度。这样就造成了渗透压差，外部的水分会进入到细胞内，造成细胞膨胀。而红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会被涨破，受到破坏。
红细胞裂解后，溶液应该是清亮透明的。经离心收集细胞时，上清为破碎红细胞，沉淀为目的细胞，小心吸弃上清液。
（2）成分AmmoniumChloride10xLysingConcentrateSolution氯化铵10x溶解浓缩液：
NH4Cl80g；
KHCOg；
Na2EDTA3.7g；
DistilledH2OmL；
1NHClor1NNaOH（调节pH值用）
（3）配制步骤a)将以上NH4Cl，KHCO3，Na2EDTA，试剂溶于ml去离子水中
b)加去离子水定容到ml,调节溶液pH值到7.2-7.4,用0.22um的滤器过滤2-8°C保存备用
c)在制备工作液时，将此储存液稀释10倍后使用
（4）保存a)10x储存液储存于2-8°C不能超过半年(六个月);
b)使用时根据需要稀释,每次用都应用去离子水新鲜配制工作液,当日用不完的可废弃。
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