本文原载于《中华骨科杂志》年第18期
骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSC）因其连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能、自我复制、低免疫原性、方便提取培养及不受伦理学限制等特点，作为用于组织工程的理想种子细胞，受较多组织工程研究者的青睐[1,2]。但不少文献表明骨髓间充质干细胞在创伤修复上也存在诸如多次传代的细胞增殖活力、分化潜能下降和易癌变等问题，目前仍然处于向临床应用的转化阶段，因此仍需对其进行大量的基础实验研究。而在对细胞的基础实验中，需要明确目标细胞是否到达靶组织、增殖、存活等，以便证明该细胞的效果，由此细胞示踪技术应运而生，即用标记物标记实验细胞，追踪标记物就能监测细胞的技术。然而运用于组织工程技术来构建组织的过程需要时间较长，要求在一定时间范围内能检测到标记物的存在；其次标记的细胞混杂在活体正常细胞中，标记的目的便是要容易识别出来；同时标记物最好不影响被标记细胞的特性与活性，因此标记系统的长期稳定性和无毒副性十分重要。因此，在当BMMSC移植后，研究人员希望能无创伤性地在活体内动态监测其的迁移分化和生存状态，从而研究发展了多种示踪技术。
根据标记物性质和标记方法的区别，目前大致可分为报告基因、荧光染料和纳米粒子3大类标记方法，它们分别或联合使用光学成像、MRI和核素成像（radionuclideimaging，RNI）等医学影像技术中的一种或多种进行观察，组成当前较为流行的几种示踪技术[3]。不同的标记方法和成像技术结合产生的示踪技术有着各自的优势与不足，这与所选择的标记物本身的性质以及影像技术的特点有关。为了得到更准确的实验结果，研究者也在不断地改进和发展新的示踪技术，因此在实验中需结合实际情况选择最佳的示踪技术。
本文以"骨髓间充质干细胞"、"示踪"、"报告基因"、"荧光染料"、"纳米粒子"等中文关键词在中国知网、万方数据库进行检索，并以"bonemarrowmesenchymalstemcell"、"tracer"、"reportgene"、"fluorescentdyes"、"nanoparticle"等英文关键词在PubMed、WebofScience数据库检索，重点纳入近3~5年的文献，检索语种为英文和中文。共检阅出篇文献，其中英文文献篇，中文文献篇。设定文献的纳入标准：①期刊论文和会议论文；②研究内容与BMMSC的示踪技术有关，包括基础研究和临床研究；③同类型的文献纳入证据等级高的文献。排除标准：①无法获得全文的文献；②信稿、报告类文献；③质量较低、证据等级不高的文献；④中、英文重复发表文献。依纳入及排除标准，最终纳入文献40篇，中文文献16篇，英文文献24篇（图1）。我们希望通过对检索出的关于骨髓间充质干细胞示踪方法的文献进行归纳总结，对近年来应用的多种示踪方法分析各自原理、优点及不足，为研究者选择BMMSC的示踪方法提供帮助，对BMMSC的示踪技术研究进展进行综述。
图1
文献筛选流程图，最终纳入文献40篇（16篇中文文献，24篇英文文献）
一、报告基因示踪技术
随着现代分子生物学的发展，特别是人类基因组测序工程的完成，大量基因技术应运而生，报告基因就是其中广为应用的技术之一。报告基因示踪技术的标记方法基本都是通过生物体结构，如质粒、病毒等载体携带报告基因转染目标细胞，使该细胞表达特异性且不能分泌到细胞外的产物，通常产物为荧光蛋白、酶、受体等，通过检测特异性产物来确定目标细胞的位置与生存情况（图2）。
图2
报告基因示踪技术示意图，报告基因与载体结合，转染目标细胞，进入目标细胞内，报告基因结合到细胞核内DNA上，而载体在胞浆内被降解，随后转染成功的细胞核表达特定且不能被分泌到细胞外的产物
（一）荧光蛋白
荧光蛋白是应用最为广泛的示踪剂，其中最有应用价值的是最早在维多利亚多管水母中提取的绿色荧光蛋白（greenfluorecentprotein，GFP）。而另一种较为常见的红色荧光蛋白（redfluorecentprotein，RFP）则是从珊瑚虫Discosomagenus中克隆的一种与GFP同源的荧光蛋白，其发射波长大于GFP，组织穿透力强，因此不需要任何预处理便可检测到[4]。荧光蛋白的发光原理为：其特有的生色团结构在较高能量的光子照射下发生构象改变，导致分子能级变化，从高能级的构象跃迁向低能级时发出较低能量的光子[5]。因此荧光蛋白需要激发光，但容易对发射光产生背景干扰，加之激发光和发射光波长均在可见光区域（~nm），而活体组织对该波段荧光的强吸收和散射作用，和其他新的示踪技术相比穿透深度低、空间分辨率低、检测灵敏度低。
（二）荧光素酶
荧光素酶报告系统是另一种相对成熟且运用广泛的技术，主要有萤火虫和海肾荧光素酶报告系统两种，它们分别特异性利用荧光素和腔肠素和发光底物产生酶促反应，发出光子进行成像。对比荧光蛋白发光原理，荧光素酶报告系统不需要激发光，其光能来源于酶促反应，因此只有在活细胞内才能发光，这可以很大程度上可以避免因激发光造成的光噪现象[6]。荧光素酶与底物结合特异性强，灵敏度高，内源性低，检测方便准确，有其他报告基因技术无法比拟的优势。Takashi等[7]构建了一个荧光素酶报告系统以更精确地监测各个阶段间充质干细胞的成骨分化情况。荧光素和腔肠素不产生交叉反应，这两种荧光素酶可通过组合进行双报告基因检测：一个报告基因活性的改变，与基因表达的特定实验条件相关；而另一个报告基因的组成型活性则提供内对照，使实验值正态化，即可减少细胞转染或裂解等变化因素带来的误差[8]。但无论哪种荧光素酶均存在成像空间分辨率低、光穿透能力弱等缺陷，因此目前也仅适用于小动物活体成像。传统荧光素酶较不稳定，室温下即失活，需长期保存于低温环境[9]。徐澍等[10]设计了耐热突变日本萤火虫荧光素酶使之在50℃时仍有活性，40℃下孵育25min后活性仍90%。Woo等[11]改进了海肾荧光素酶并命名为m-Rluc8，其发光强度是传统荧光素酶的5.6倍。Hall等[12]开发了新的19kd的NanoLuc荧光素酶和底物furimazine，使发光效率达到传统荧光素酶的倍。
（三）β半乳糖苷酶
β半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）是LacZ基因的表达产物，由4个亚基组成四聚体，较为稳定，用X-Gal为底物进行染色时呈蓝色，便于检测和观察，即蓝白筛选[13,14,15]。原本这种成像技术的检测样本来自组织解剖，不能在活体内观察，但近年来研究者发现LacZ报告基因可用MR检查来检测。Louie等[16]通过转基因细胞表达LacZ基因，并通过β-gal基质类似物激活反应产生MR检查可检测到的对比图像。Bengtsson等[17]利用S-Gal在β-Gal存在时与三价枸橼酸铵形成MR检查可见的沉淀物，使之能在活体上直接观察。
（四）铁蛋白
铁蛋白是一类普遍存在于生物体内，可以与铁特异性结合来储藏铁的蛋白质，其有24个亚基组成一个内空心结构。每个亚基由轻链或重链的形式存在，轻链对铁蛋白起稳定作用，而重链具有亚铁氧化酶活性，将细胞摄取来的Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+以高度不溶的Fe（OH）3的形式储存于空腔内，使得Fe2+氧化反应持续进行，直至空腔内形成铁核。每个铁蛋白内约有个铁离子，可引起MR检查的信号改变。大量体内外研究表明铁蛋白的表达可明显缩短MR检查的T2时间弛豫，使得在T2WI中能检测该报告基因的表达情况[18,19,20]。Naumova等[21]探测过表达铁蛋白的干细胞对比普通干细胞可缩短25%的T2弛豫时间。相比于报告基因光学成像，MR扫描具有很高的组织穿透深度和分辨率，同时又可以获得解剖和生理信息。
二、荧光染料示踪技术
荧光染料大多是含有苯环或杂环等带有共轭双键的化合物，含有能与核酸、碳水化合物和肽共轭连接的基团。该共轭物一般情况下稳定性好，在紫外或可见光的照射下，相比于其他的荧光物质或颜色标记物具有更优异的溶致变色效应，已成为一个很好的可供生物学研究（蛋白标记和DNA标记）使用的专门染料。荧光染料示踪技术的标记方法无需通过生物体结构，染料能直接与目标细胞膜上特定位点或细胞内蛋白质结合，观测荧光来确定目标细胞的位置和分裂情况（图3）。常见的荧光染料主要有氯甲基苯甲酰胺（chlorobenzamide1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine，CM-Dil）、二脒基苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（5，6-carboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester，CFSE）等。
图3
荧光染料示踪技术示意图，荧光染料可与细胞膜结合，如CM-Dil；荧光染料也可进入细胞内与胞浆中蛋白质结合，如CFSE；荧光染料可与细胞核内DNA结合，如DAPI
（一）CM-Dil
Dil是一种亲脂性长链碳花青染料，易嵌入生物膜内并在膜内作定向扩散运动，从而标记整个细胞，荧光显微镜下发橙色光。还可以通过胞饮作用进入胞质，从而标记整个细胞质。Dil掺入膜中时荧光变强，稳定性好，荧光时间长，在标记细胞内消失慢，不容易在标记与非标记细胞之间传递，无细胞毒性[1]。CM-Dil为DiI的衍生物，是在DiI中加入氯甲基替代基团，使CM-Dil能够抵抗醛类的固定作用及通透、脱水、石蜡包埋的影响，较DiI更适合标本长期追踪，近年来已基本替代DiI在细胞示踪方面的使用[22]。Al-Ani等[23]利用CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞和肌腱干细胞治疗大鼠跟腱断裂，直到第4周仍能检测得到。
（二）DAPI
DAPI是常用的核酸和染色体复染剂，与DNA的AT区域结合后，在紫外光激发下能发出蓝色荧光，但目标细胞死亡后，DAPI可能被周围细胞摄取而出现假阳性。Shang等[24]对照CM-Dil与DAPI标记大鼠骨髓间充质干细胞的差异，发现CM-Dil组冰冻切片红色荧光比DAPI组的蓝色荧光边界清晰且背景色低，CM-Dil组还可通过含细胞核染色的封片剂封片来排除荧光假阳性。
（三）CFSE
CFSE也称5，6-carboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester（CFDASE），具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidylester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性从而进入细胞；而当其进入细胞内环境后，内源的酯酶将其乙酸基团水解，这时CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidylester基团能与细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，形成具有绿色荧光的蛋白加合物而存在于胞质中[25]。细胞经CFSE染色后，在分裂增殖的过程中，CFSE会平均分配到子代细胞中，使荧光强度呈指数减弱，虽然只适用于短时期示踪，但可据此推断目标细胞的传代情况。Fayyad-Kazan等[26]运用CFSE标记T淋巴细胞在单独和与BMMSC共孵育情况下培养5d，应用流式细胞仪分析发现：共孵育的CFSE峰值下降近一半，证实BMMSC会抑制T淋巴细胞增殖。
三、纳米粒子示踪技术
有研究发现当物质的结构单元小到纳米级，其性质就会发生重大改变，可以使材料在光学、催化、热学、光化学以及敏感特性等方面具有一系列新特性。随着纳米技术在医学领域的发展，一系列纳米粒子如磁氧化铁纳米颗粒、量子点等被应用于示踪技术，展现了它们巨大的优势。纳米粒子示踪技术的标记方法最为简单直观，只需要纳米粒子和目标细胞共孵育一段时间，细胞通过吞噬作用摄入纳米粒子，检测纳米粒子即可了解目标细胞的位置（图4）。
图4
纳米粒子示踪技术示意图，将纳米粒子与目标细胞共孵育，目标细胞通过胞吞等作用摄入纳米粒子，纳米粒子在目标细胞内被囊泡包裹，不能被分解吸收，也不能排出细胞外
（一）磁氧化铁纳米颗粒
磁性氧化铁纳米颗粒是近年来运用于细胞示踪最多的纳米粒子标记物，按其粒径大小可分为超顺磁性氧化铁粒子（superparamagneticironoxideparticles，SPIO）、超微磁性氧化铁粒子（ultrafinemagneticironoxideparticles，USPIO）和单晶体氧化铁纳米粒子（monocrystallineironoxidenanoparticles，MION），但大部分研究人员习惯用SPIO来标记干细胞，因其对骨髓基质细胞具有高而稳定的标记率。SPIO无磁场时磁性极弱，但在很弱的磁场内就能表现出较大的磁性，这种磁性的变化就是超顺磁性。SPIO在细胞中聚集，造成局部磁场不均匀，加速质子去相位过程，显著缩短T2弛豫时间，从而使目标细胞在MRI上得到示踪[27]。而单纯的SPIO易聚集沉淀且表面所带负电荷与细胞膜相斥，影响细胞吞噬，同时高浓度铁具有一定细胞毒性且容易在细胞内被降解，故需对其表面进行修饰，目前多用的外壳是二氧化硅或多糖类聚合物[28,29]。无论外壳包裹铁核心的结构还是成像原理都与铁蛋白相似，可以说是一种分子层面的仿生。Naumova等[30]对比SPIO和铁蛋白在治疗小鼠心肌梗死的细胞移植示踪实验发现，SPIO在T2弛豫信号上强于铁蛋白，但铁蛋白能够反映干细胞是否存活。同时随细胞分裂导致每个细胞内SPIO含量减少，MRI信号降低影响观察；细胞死亡后SPIO又有可能被周围巨噬细胞吞噬从而产生假阳性。
（二）量子点
量子点（quantumdots，QDs）是指可加工成粒径为纳米级的一类半导体纳米晶体，传统量子点主要是Ⅱ~Ⅵ族（CdTe、CdSe）或Ⅲ-Ⅴ族（InP、InAs）半导体组成[31]。应用于标记的量子点同样为核/壳结构，如CdSe/ZnS（CdSe为内核ZnS为外壳）。内核决定其光学特征，而外壳影响其水溶性、标记能力及稳定性[32]。理论上，传统荧光物质能应用的技术领域，量子点也可以应用，而与传统荧光示踪技术相比，量子点还具有以下优势：激发光谱宽、发射光谱窄、荧光强度强，稳定性好，可被多次激发，荧光寿命长，可实现长时间动态监测，显著提高分析方法灵敏度和分辨率；通过调节粒径大小，可获得更多不同荧光颜色的量子点[32,33,34]。然而传统量子点高含量的重金属Cd具有细胞毒性，限制了其应用[35]。一种解决方法是开发新的无毒的量子点，如低毒且价廉的碳量子点（CQDs）、更高空间分辨率的近红外二区硫化银量子点（NIR-IIAg2SQDs）[36,37]；另一种解决方法是在传统量子点上再包裹一层生物相容性的涂层，如Rizvi等[38]开发出的POSS-PCU外壳涂层。
综上所述，三类示踪技术在BMMSC修复组织或器官损伤时均已被大量使用，成为验证实验成功与否的有力证据。具体选用哪种示踪方法，与研究目的、动物材料、靶组织的深浅、作用所需的时长、所需实验结果的精确度等有关。
总体比较三类示踪技术可发现：报告基因示踪技术操作最为复杂，依靠生物体结构转染细胞使标记率较低，在活体示踪前需筛选，但报告基因能随细胞分裂过程传达给子代细胞，且几乎只有在活细胞体内才能发挥作用，适合在小动物上检测目标细胞是否存活及功能的研究，但同时也要考虑其转基因的风险。而荧光染料示踪技术直观方便，能够分析细胞繁殖情况，但镜检及鉴定时需要制备组织切片，且荧光时间较短，不适合活体长期示踪，荧光染料亦会随着细胞代谢减弱或者转移到未标记细胞上从而导致灵敏度下降，在要求更加精确示踪的今天已较少单独使用。纳米粒子示踪技术则以简单安全的操作手段，分辨率、特异性、灵敏性、标记率基本均高于其他技术的巨大优势成为热门技术，但也存在无法确定细胞存活状态、目标细胞死亡后出现假阳性等问题，作为一种新兴技术，仍有发展的空间。
目前，研究者们除寻找新的示踪技术以外，也提出将现有示踪技术结合使用达到取长补短的效果，即联合标记法和对其成像的多模态成像技术：如Cao等[39]利用CYI染料和USPIO联合标记BMMSC，对其在大小鼠急性心梗模型上进行示踪，可在高分辨率定位同时掌握移植细胞存活状况。而Nakamura等[40]则将thiolOS-MNP/Rho，一种可结合荧光染料的有机硅作为磁性氧化铁纳米颗粒外壳涂层。但联合标记法同时也需要考虑经济效益、原有示踪技术缺陷的叠加放大以及是否会产生新的缺陷等问题。
总之，无论是寻找新技术还是改进旧技术，一个更为理想的示踪技术不仅能使研究者更加清晰全面地了解BMMSC在体内外的各种状态及功能，从而为BMMSC能够更早地应用于临床，还能促使不同学科领域技术互相"碰撞"，擦出新的思维火花，进而推动科学进步。
“参考文献略”
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