发表期刊：年NatureCommunications
摘要：
骨稳态平衡由骨形成成熟成骨细胞（mOBs）和骨吸收成熟破骨细胞（mOCs）调控。骨重塑过程开始于破骨细胞的骨吸收，然后是成骨细胞的骨形成，在解剖学上，发生股重塑的不同的部位称为基本多细胞单位（BMUs）。在BMU水平上，当发生骨结构和代谢变化时，严格调控骨重建过程对于维持骨结构平衡至关重要。骨重塑通过每个BMU中的成骨细胞和破骨细胞之间复杂的细胞通路严格控制。因此，了解成骨细胞（及其前体间充质成骨细胞）和终末分化的骨细胞和破骨细胞（及其前体单核细胞）在体内的时空关系和相互作用是至关重要的。具体来说，因为骨吸收和形成发生在时空不统一的活性细胞汇总，因此这些细胞是否存在相互的物理作用仍有待阐明。
活体双光子显微镜技术的进步在生物成像领域开创了一个新时代。双光子显微镜的近红外激发光可以穿透较厚的标本，在时间和空间上观察到活细胞的信息，并可以可视化观察到细胞行为及细胞之间的相互作用。因此，活体双光子显微镜可用于在体内观察骨组织内的活细胞。
本文中，我们研究成熟的成骨细胞（mOBs）和成熟的破骨细胞（mOCs）在体内的相互作用。使用双光子显微镜，mOB由I型胶原启动子驱动的增强型青色荧光蛋白（ECFP）表示，mOC由抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）启动子tdTomato（红色荧光蛋白）表示。因此，成熟成骨细胞和成熟破骨细胞可以在活体内同时观察到。
同时观察到的结果表明：尽管不同细胞之间的相互接触是时空限制的，但在稳定状态下，成熟成骨细胞和成熟破骨细胞占据独立的位置。利用一种检测骨吸收质子分泌的新型荧光探针，表明与mOB直接接触可抑制mOCs引起的骨吸收。另外，结果显示这些相互作用模式根据骨稳态条件动态改变而做出变化；间隔性给予引起骨形成的甲状旁腺激素（PTH）处理，可以增加这两种细胞类型之间直接相互作用的频率。
结果：
1、构建成熟成骨细胞mOBs、成熟破骨细胞mOCs荧光标记鼠
双光子显微镜下显示：青色表示成熟成骨细胞、红色表示成熟破骨细胞。
2、活体内同时观测mOBs和mOCs细胞
上图C显示，成骨细胞和破骨细胞空间上相互独立。
上图D显示，存在一些mOB-mOC以时空有限的方式发生接触。
上图E显示，延时图像分析表明，mOB和mOC细胞之间存在?10μm间距。
以上成像结果表明，mOBs和mOCs分别处在不同的区域，只是在时空有限的区域发现了一些直接的细胞间接触。
3、与mOB接触会抑制mOC的骨吸收活性
为了检查这两种细胞之间直接细胞-细胞接触的功能意义，使用pH传感化学探针pHocas-3，我们检测了mOC的骨吸收能力。
图示：计算破骨细胞boneresorbingindex(BRI)的骨吸收能力的计算方法。
上图g示：实心箭头表示mOB和mOC发生接触的细胞，空心箭头表示未发生细胞接触的细胞。
上图h示：发生相互接触与未发生相互接触的破骨细胞的吸收能力。
以上结果表明，mOB通过直接的细胞-细胞接触方式抑制mOC的骨吸收能力。
4、间隔性给予PTH处理引起接触分布
文献显示间隔性给予PTH处理，通过调节成骨细胞和破骨细胞之间的通讯来诱导骨合成代谢作用，但是具体的通讯方式仍未阐明。为阐明PTH促进骨形成的机制，作者首先构建了PTH处理小鼠的模型。
与未处理的小鼠相比，PTH处理3周后，小鼠表现出皮质骨体积的显着增加，处理6周后皮质和松质骨体积均显著增加。
放大视图显示，随PTH处理时间的延长，不仅mOB和mOC的数目发生变化，而且mOB和mOC的分布也发生显着改变。
5、细胞接触会抑制PTH处理小鼠的骨吸收能力
图示说明：绿色表示pHocas-3探针，青色表示成熟成骨细胞，红色表示成熟破骨细胞，蓝色表示骨组织。
在PTH处理时1周时，mOCs的数量首先增加，并分泌酸性物质；在PTH处理后期阶段（3周和6周时），mOBs增殖受阻，表现出数量增加。表明mOBs与mOCs的接触增加，导致抑制破骨细胞骨吸收。
总结：
作者首次应用活体双光子成像来检测体内骨中mOB-mOC的接触。活体双光子骨骼成像的优点是，它能够在焦平面上对骨骼进行二维扫描，以观察细胞形状以及体内mOB和mOC的出现。与传统的组织形态计量学分析显着不同，通过这种分析，骨表面被表示为沿骨小梁的一维线。尽管我们也能够进行体外实验并观察mOB和mOC之间的相互作用，但体外情况与体内明显不同，因为体外并不能重现体内骨髓的生理微环境。
作者首先观察到，在生理状态下，mOBs和mOCs在各自的微环境内发挥作用，这一观察结果与先前的发现一致，即骨形成和骨吸收区彼此分离。此外，我们发现，与mOB接触的大多数mOC显示树突形状，突触向mOBs延伸，并且这些突触在保持与mOB接触的同时积极地移动，导致mOC具有更高的运动能力，mOCs与mOBs直接接触的程度与mOCs的骨吸收活性呈负相关，与运动力呈正相关。
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