摘要
制备明胶和β-磷酸三钙(β-TCP)作为仿生骨材料的三维打印支架，为骨再生提供了良好的环境。β-TCP中的Ca2+与明胶中的COO?形成稳定的静电相互作用，复合支架具有良好的生物打印流变性。用戊二醛水蒸气交联明胶/β-TCP支架，通过甘氨酸洗涤去除可能对细胞产生毒性的未反应醛基。傅立叶变换红外光谱(FTIR)和降解率表明该水凝胶结合稳定。
结果表明，复合支架具有与松质骨相近的抗压强度，含40wt%明胶的60wt%β-TCP组与前成骨细胞具有良好的细胞活性。此外，在动物实验中，明胶/β-TCP支架证实可以诱导骨形成，没有任何炎症反应。这项研究表明，这些人造支架可以作为骨再生的潜在骨替代材料。
通常，用于骨替代的组织工程支架包括具有相互连接的孔的生物相容性结构，这些孔诱导细胞粘附并提供有利于骨组织形成的环境。用于骨替代的常用材料使用金属植入物(如钛合金和不锈钢)以及聚合物支架(如合成聚合物和天然聚合物)。由于金属植入物的不可降解性和高刚性，可生物降解聚合物支架在骨再生方面得到了广泛的研究。制备此类支架的常用方法有颗粒浸出法、静电纺丝法和冷冻干燥法。然而，这些方法在制造过程中的重复性和通用性有限。为了解决这些问题，应用了通过堆叠打印材料来制造支架的3D生物打印技术。这种3D生物打印技术可以控制所制造的结构，使得它只包括相互连接的网络，并且还可以控制支架的形状。相互连通的毛孔是组织工程支架的重要组成部分，因为它们在细胞存活、迁移、增殖和分化方面发挥作用。此外，生物打印可以保证重复性。本研究采用三维生物打印系统(方案1)，将明胶和β-TCP纳米颗粒分别作为骨的有机部分和无机部分制备仿生支架。在生物打印前，我们分析了以不同比例制备的明胶/β-TCP复合水凝胶的剪切变稀行为、硬度和凝胶点等流变特性，以确定其作为生物打印材料的适用性。其次，考察了这些水凝胶的印刷性能，并对在最佳条件下制备的支架的降解性能和力学性能进行了分析。扫描电镜观察了复合支架表面对细胞附着和迁移的影响。为此，我们还对种植在支架上的前成骨细胞的活性、迁移、增殖和骨分化能力进行了体外实验，以分析该支架应用于骨组织再生的可行性。
方案1.利用3D打印技术的骨组织工程仿生支架的制造方法
为了考察明胶/β-TCP复合水凝胶的印刷适宜性和力学性能，对其流变性能进行了分析。对于3D生物打印，水凝胶必须具有剪切稀释性。根据剪切速率测量粘度时，所有组均表现出剪切变稀行为，证实水凝胶是可挤压材料(图1a)。
为了根据β-TCP的比例评价水凝胶的力学性能，在扫频过程中测量了G‘。随着β-TCP量的增加，G‘值增大，说明水凝胶的刚性增加(图1b)。根据水凝胶的温度对凝胶点进行了分析，以确认生物打印的稳定性。所有四组均处于低于31°C的凝胶状态，β-TCP的用量对水凝胶在室温下的印刷适宜性没有显著影响(图1c)。
图1、水凝胶的流变特性。A)根据剪切速率的粘度行为，b)根据频率的剪切储存模量，以及c)根据温度的凝胶点
3D打印条件取决于要挤出的股的厚度和形状。打印的链可以是不连续的或均匀的，或者以溢出为特征。挤压压力不同，而其他条件保持不变(表2)；通过光学观察得到的条带(图2a)。明胶、G80T20、G60T40和G40T60水凝胶分别在、、和kPa下挤出均匀。随着β-TCP量的增加，获得均一链需要更高的压力。这是因为生物打印材料挤压时所需的压力与材料的硬度有关。因此，硬度最高的G40T60水凝胶需要相对较高的压力。在优化压力下制备的复合支架在显微镜下观察，证实了纤维的厚度为μm(图2b)。
图2、明胶/β-磷酸三钙水凝胶的印刷适宜性。A)挤出的均匀性，以及b)表示3D打印对象的各种视图。
用2.5%戊二醛交联的复合支架中明胶和β-TCP的傅里叶变换红外光谱如图3所示。在复合支架中，由于?-TCP中的钙离子与明胶中的羧基之间的静电相互作用，明胶支架的cm?1处的峰移动到了更高的波数(cm?1)。这种傅立叶变换红外光谱分析证实了明胶和β-TCP在支架中的存在，并且这些组分之间存在稳定的相互作用。
图3、冻干明胶/β-三钙磷酸盐(β-TCP)支架和β-TCP粉末的傅里叶变换红外光谱。
支架的X射线衍射图谱如图4所示。明胶在2θ=20-25°处有一个大而宽的峰，表明明胶为无定形区域。所有复合支架中都出现了β-TCP峰。随着明胶含量的增加，由于无定形明胶含量的增加，这些峰的强度降低。
图4.冻干明胶/β-三钙磷酸盐(β-TCP)支架和β-TCP粉末的X射线衍射图谱。
冻干支架的表面形貌如图5所示。研究发现，明胶基质在支架中形成了相互连通的多孔结构，β-TCP纳米颗粒均匀分布在明胶相中。冷冻干燥过程后，由明胶组成的支架不再保持其形状，但纳米颗粒的加入有助于保持链的均匀结构。
图5、不同放大倍数下的扫描电子显微镜图像，以评估干燥样品的表面形态和微观结构。
支架必须有足够的机械强度来承受体内的负荷，然后才能逐渐降解，因为新的组织会产生并取代它。进行了压缩测试，以分析打印支架的机械性能(图6)。
图6、应力-应变曲线和b)根据β-三钙磷酸盐比例的支架的抗压强度
在组织再生过程中，支架的分解能力是必不可少的，因为一旦植入受损组织，它就会被分解，并被新组织取代。在PBS中，孵化样品的降解被测量了长达4周，并对冷冻干燥样品进行了称重，以获得WD值(图7)。结果表明，明胶支架开始降解，明胶/β-TCP复合支架的降解速率随β-TCP含量的增加而降低。这表明羧基和钙离子之间的静电相互作用通过消耗明胶中的亲水性基团来抑制支架的分解。因此，我们建议可以通过预先选择其组成的比例来控制复合支架的降解速率。图7、明胶/β-三钙磷酸盐支架在37°C磷酸盐缓冲盐水溶液中的降解
图8a显示了通过活/死试验测量的MC3T3-E1细胞在支架上的附着和活性。在24和72小时之后，证实大部分细胞附着在β-TCP比例最高的G40T60组的链上。已知交联法产生的未反应醛基会造成毒性，但当通过活/死图像观察细胞存活率时，研究证实甘氨酸的封闭反应是成功的，因为死亡细胞很少。
图8、a)活/死染色图像和b)种植在明胶/β-三钙磷酸支架上的前成骨细胞的扫描电镜图像。
通过WST-1实验测量反应溶液的吸光度(即光密度)来分析支架上的细胞增殖(图9a)。在孵育4、7和10天后测量吸光度。G40T60组细胞增殖率最高。细胞增殖持续7d，然后下降到10d。这种减少可以用细胞分化来解释。培养7天和10天后，根据DNA含量计算碱性磷酸酶(ALP)活性，表明支架上前成骨细胞的分化程度(图9b)。随着时间的推移，复合支架的碱性磷酸酶(ALP)活性增加。
图9、a)线粒体活性测定(WST-1)检测MC3T3-E1前成骨细胞在复合支架上的增殖情况。OD：光密度。B)种植在复合支架上的成骨前细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性
在手术过程中，明胶和明胶/β-TCP支架的结构完整性保持不变。支架与缺陷吻合良好，易于操作(图10a)。在这项研究中，一个临界大小的颅骨缺损模型被用来评估新骨形成。当存在临界大小的缺损时，除非进行再生干预，否则不会发生自发愈合；临界缺损大小因种类和缺损类型而异。例如，8mm的颅骨缺损对大鼠来说是严重的，而15mm是兔的临界大小。临界大小的缺损动物模型有利于测量新骨形成，从而避免高估手术造成的缺损模型中与自然愈合相关的骨再生。图10、a)手术过程照片，b)显微CT图像，c)苏木精-伊红(HE)染色，d)Masson三色(MT)染色，e)用支架对新形成的骨进行定量测量
在本研究中，研究团队制备了稳定的明胶/β-TCP水凝胶，它是通过静电相互作用形成的，并通过红外峰位移和降解实验进行了验证。采用三维生物打印技术成功制备了明胶/β-TCP复合支架。根据打印支架的抗压强度，含有β-TCP的支架与松质骨相似。扫描电镜显示，β-TCP纳米粒子均匀分布在明胶相中，形成粗糙的表面，影响细胞的响应。
种植在复合支架上的前成骨细胞在G40T60上表现出最高的活力、迁移、增殖和分化，其中含有最多的β-TCP。在动物实验中，明胶/β-TCP复合支架周围的骨形成比单独的明胶更多，因为β-TCP的存在提供了一个类骨的环境，从而诱导了骨矿化。因此，建议的G40T60支架作为骨组织再生的骨替代物具有很大的潜力。
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