谢肇教授骨诱导膜活化灭活骨修复骨缺损的实 [复制链接]

作者：

汪小华1，魏富达1，喻胜鹏1，李伟1，黄科1，董世武2，谢肇1

作者单位：

第三军医大学:医院骨科，国家地方联合工程实验室，全军矫形外科中心1，生物工程学院生物医学材料学教研室2）

目的：构建骨缺损诱导膜模型，探讨骨诱导膜对灭活移植骨成骨诱导活性的作用。

方法：32只新西兰大白兔一期在桡骨中段制造骨缺损模型，植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥诱导生物膜形成。第6、8周分别处死4只取出诱导膜检测骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)含量并切片作HE染色，取同只兔皮下组织作为对照。其余24只兔在一期植入骨水泥后6周取出骨水泥进行二期手术，按随机数字表法分为实验组、模型组和对照组，每组8只。实验组保留诱导膜并在膜内植入灭活骨，模型组保留诱导膜不植骨，对照组去除诱导膜植入灭活骨。二期处理后第8、12周通过放射学和组织学评估新生骨形成情况。

结果：ELISA检测表明在第6、8周诱导膜中BMP-2含量［(．40±20．75)、(．67±30．05)pg/mL］、VEGF含量［(．33±38．85)、(．84±18．20)pg/mL］均高于皮下组织(P＜0.05)，同时在诱导膜切片HE染色中观察到软骨内骨化;放射学检测可见二期处理后第8、12周实验组成骨优于模型组和对照组(P＜0.01)，模型组有少许骨痂形成，对照组无成骨;第8、12周组织学观察实验组可见骨细胞和软骨细胞形成，成骨优于模型组和对照组(P＜0.01)，对照组仅有纤维连接，未见骨细胞和软骨细胞。

结论：骨诱导膜含有间充质干细胞和高浓度的细胞因子，从而促进灭活移植骨重建骨缺损。

［关键词］诱导膜;骨重建;灭活骨;间充质干细胞

四肢节段性骨缺损的重建是目前临床中常见难题之一，多由创伤、感染、肿瘤等因素导致［1－3］。理想的重建目标不仅要实现结构稳定，更要达到功能恢复。年Masquelet等［4］报道了使用聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)骨水泥结合自体松质骨移植的方法修复四肢骨缺损的新技术，叫做诱导膜技术。该技术分为2个阶段，首先对病变部位彻底清创，植入PMMA骨水泥诱导生物膜形成;6～8周取出骨水泥并在膜内植骨。该技术修复骨缺损成功率为88%～%，能够成功修复长达25cm的骨缺损［5－7］。目前认为，诱导膜能阻止周围组织侵入骨缺损部位，同时能防止移植骨被吸收，另外诱导膜含有丰富的血管组织，并且能分泌促进成骨和促进血管形成的细胞因子如骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)等［8］。同时，诱导膜还可能含有间充质干细胞，可向成骨方向分化促进移植骨成骨过程［9－10］，但目前还未得到证实。本研究通过在封闭的诱导膜内植入灭活移植骨材料对骨缺损进行重建，探讨其可行性，观察骨诱导膜是否含有间充质干细胞和高浓度的细胞因子从而促进灭活移植骨成骨，以期为进一步研究诱导膜技术修复骨缺损奠定基础。

健康成年新西兰大白兔32只，雌雄不限，体质量(2．35±0．12)kg，由医院实验动物中心提供［动物合格证号SCXK(渝)-］。

10%多聚甲醛，5%硝酸，无水乙醇，HE染色所需试剂，戊巴比妥钠(Merck公司)，BMP-2ELISA检测试剂盒(Uscnk公司)，VEGFELISA检测试剂盒(Uscnk公司)，显微镜成像系统(OLYMPUS)。

24只实验兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠1mL/kg，麻醉后固定于手术台，左前肢常规剃毛，消毒，铺无菌巾，桡前外侧作弧形切口，分离桡骨中段，去除骨膜，锯断15mm形成桡骨缺损，将PMMA骨水泥植入缺损部位，逐层缝合，肢体不做固定，术后0、24、48h每只肌注青霉素0IU/kg。常规条件喂养6周后按随机数字表法分为实验组、模型组、对照组，每组8只。实验组保留诱导膜植入经高温水浴(℃30min)灭活的自体髂骨，模型组保留诱导膜不植骨，对照组去除诱导膜后植入经高温水浴灭活(℃30min)的自体髂骨。逐层缝合手术切口，患肢不做固定，术后0、24、48h给予青霉素0IU/kg肌注，常规饲养条件喂养。

8只实验兔按1．3方法植入骨水泥后6、8周分别处死4只兔子取出诱导膜和皮下组织用于检测BMP-2、VEGF的表达，将样品取出充分匀浆后置于离心机中离心10min，取上清液并按说明书进行稀释。加入稀释好的标准品50μL于反应孔，再加入待测样品50μL、生物素标记的抗体50μL，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育60min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。每孔先加入显色剂μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10min。每孔加终止液50μL，终止反应。用酶标仪检测各孔的光密度值［D()］，计算出对应的样品浓度。

实验兔二期处理后第8、12周X线检查统一曝光条件为40kV、20mA、0．12s，按Lane-SandhuX线评分标准评价。

采集植入PMMA骨水泥后第6、8周诱导膜和二期处理后第8、12周移植骨标本，用10%中性甲醛溶液固定24h，常规脱钙(5%硝酸)、再固定、脱水、透明、浸腊包埋、切片，常规脱蜡，梯度乙醇脱水;苏木精核染5min，自来水冲洗2min;盐酸乙醇分化30s;自来水泡15min;置伊红2min;无水乙醇脱水;二甲苯透明，中性树胶封固。按Nilsson组织学评分标准进行评分。

采用SPSS17．0统计软件，对多个样本均数进行两两比较和Wilcoxon秩和检验。

BMP-2、VEGF蛋白表达在第6、8周诱导膜中的BMP-2、VEGF含量明显高于皮下组织(P＜0.05，表1)。

二期处理后第8周实验组可见新生骨形成，骨折线部分存在，模型组和对照组未见新生骨;第12周实验组骨缺损已基本重建完成，骨折线模糊，模型组可见少量骨痂形成，对照组两端呈硬化表现(图1)。二期处理后第8、12周实验组骨缺损修复情况明显优于模型组和对照组(P＜0.01)，模型组成骨情况优于对照组(P＜0.05，表2)。

二期处理后8周实验组有编织骨形成，骨细胞和软骨细胞多见，模型组和对照组仅见纤维连接;第12周实验组见编织骨向板层骨转化，模型组可见纤维连接，断端分界明显，对照组仅可见纤维连接(图2)。二期处理后第8、12周实验组骨缺损修复情况明显优于模型组和对照组(P＜0.01)，模型组成骨优于对照组(P＜0.05，表3)。

第8周诱导膜组织切片HE染色观察到软骨内骨化(图3)。

Masquelet等报道的诱导膜技术受到广泛的