骨是一种具有自我修复和重塑能力的再生器官。然而，大的骨缺损、病理性骨折、代谢性疾病和衰老，都可能损害愈合。目前临床治疗严重骨缺损的方法包括自体骨移植、同种异体骨移植和骨移植替代物。然而，所有这些都带来了一些挑战，如有限的可用性、可能的免疫反应和/或疾病传播、无法被塑造成不规则的几何形状，以及相当大的费用。因此，组织工程，需要独立或联合使用细胞、生长因子和支架，已经成为一种有希望的策略，可以持续促进骨再生，同时克服目前治疗策略的局限性。医院YuweiLiu等人探索MSC-mECM构建物在体外和体内产生骨的能力，包括连续性骨冷凝、软骨形成和成骨（图1）。由于骨骼发生开始于细胞间相互作用介导的间充质细胞凝聚，我们还研究了MSC-mECM结构在开始培养期后的分子事件。我们假设当MSC-mECM暴露于软骨生成和成骨的介质中时，它是依次构建的，从而模拟软骨内骨化（ECO）。与仅在成骨培养基中培养的MSC-mECM结构相比，这将产生更强健的骨形成，其模拟了膜内成骨（IMO），并已广泛应用于当前的成骨诱导方案中。采用免疫荧光法和Westernblot法对缩合过程进行了检测。体外软骨形成和成骨的特点是实时PCR，组织学和免疫染色。通过肌内植入预先培养的MSC-mECM构建物评估小鼠体内骨形成。图1实验设计示意图。融合培养10天后，对MSCs进行胰蛋白酶预处理，促进ECM收缩。MSCs沉积的细胞外基质作为软骨和骨形成的支架。骨髓间充质干细胞在成软骨介质中连续冷凝成软骨28天，然后在体外（成骨介质）或体内成骨。MSC在10天内生长到融合并分泌mECM，在此期间，新生MSC-mECM结构在塑料表面形成。在短暂暴露于0.25%的胰蛋白酶EDTA并在转移至96孔锥形底板后离心，评估了MSC-mECM在软骨形成培养基（CM）中的体外分化能力。以前它被证明促进了肥大软骨的形成。与第0天的对照组和在生长培养基（GM）中培养28天的对照组相比，在CM中培养28天的MSC-mECM构建物经历了强有力的软骨生成，富含蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基质证明了这一点（COL2，图2）。CM还上调SOX9的转译（图3A）和SOX9、aggrecan和COL2的转录（图3B），下调MSC标记CD的表达水平（补充图1（图S1））。重要的是，在CM培养基中培养的MSC-mECM结构也显示了肥大标记物的上调。即，免疫组化显示碱性磷酸酶（ALP）和Ⅹ型胶原（COL10）呈强阳性染色（图2），而qRT-PCR显示ALP、COL10和印度刺猬（IHH）基因表达上调（图3B）。图2MSC-mECM结构在体外进行了强有力的肥大软骨形成-组织学研究。MSC-mECM在生长培养基（GM）或软骨生长培养基（CM）中培养0天或28天后，对其COL2、ALP和COL10进行番红O染色和免疫组化分析。比例尺?=?50?μm。图3MSC-mECM结构在体外进行了强有力的肥大软骨形成-westernblot和实时PCR。（A）免疫印迹法检测SOX9在第0天和第28天后在GM或CM中的表达（左）。表达水平用条带强度定量（右）。（n=4个生物复制品）。*p0.05分，**p0.01分，***p0.分，****p0.0.（B）MSC-mECM结构中软骨生成和肥大标志物在GM或CM中的基因表达。数据为平均值±标准差（n=4个生物复制品）。**，p0.01分；****，p0.0.在证实MSC-mECM构建物在CM中培养4周后发生肥大软骨形成后，研究了体外MSC-mECM软骨形成的保真度，并与已知的体内骨骼形成阶段进行了比较。在1天内，MSC-mECM构建物显示细胞凝聚（图4A），花生凝集素（PNA；图4A）染色阳性，花生凝集素是一种选择性结合软骨分化前细胞聚集物的凝集素。PNA结合持续到第3天，第5天下降。这是N-钙粘蛋白（图4A-B）的表达所反映的一种模式，N-钙粘蛋白是软骨前凝聚所必需的细胞粘附分子。有趣的是，N-钙粘蛋白表达和PNA结合的下调与软骨生成转录因子SOX9和细胞表面受体CD44的上调一致（图4B）。综上所述，MSC-mECM结构再现了软骨内成骨过程中间充质细胞凝聚先于软骨分化的最早成骨事件。
图4生态方案中的MSC-mECM结构概括了早期的冷凝和软骨形成事件。（A）在第0、1、3、5天对PNA、N-钙粘蛋白和CD44进行HE和免疫荧光染色。面板中的比例尺量化。（B）第0-5天凝缩和软骨生成标记物的Westernblot（左），定量（右）。
为了进一步研究N-钙粘蛋白介导在MSC-mECM缩合和随后软骨形成中的作用，在软骨形成介质暴露之前，将构建物暴露于可溶性N-钙粘蛋白单克隆抗体（20μg/mL，Sigma）72小时。与用空白小鼠IgG对照物预处理的MSC-mECM结构相比，N-cadherin的阻断减少了MSC-mECM的收缩和细胞聚集（图5A）。结果，随后的软骨生成被抑制，如SOX9（图5B）的翻译减少和软骨生成标记SOX9、ACAN和COL2的基因表达减少（图5C）所示。这些结果与N-钙粘蛋白在体内骨骼形成中的既定作用一致，在这一过程中，N-钙粘蛋白的胞外结构域促进细胞-细胞结合和细胞聚集激活的胞质结构域，从而上调软骨形成（图5D）。图5N-钙粘蛋白在MSC-mECM结构中的中和抑制冷凝和软骨形成。（A）用N-钙粘蛋白中和抗体或IgG阴性对照物处理MSC-mECM构建物，在体外生态方案的第6天用HE染色。（B）用N-钙粘蛋白中和抗体或IgG阴性对照处理CM培养的MSC-mECM，在第0、1和6天进行SOX9翻译的Westernblot。数据为平均值±标准差（n=4个生物复制品）。****p0.0.（C）N-cadherin-Ab或IgG对照组在MSC-mECM构建物中软骨生成标志物的基因表达。数据为平均值±标准差（n=4个生物复制品）。***p0.分，****p0.0.（D）N-钙粘蛋白Ab对冷凝作用的示意图。N-cadherin-Ab结合MSCs中N-cadherin的胞外结构域，防止细胞粘附和MSC-mECM冷凝。
在各自的培养基中培养4周后，将来自ECO和IMO条件的MSC-mECM构建物肌内植入小鼠后肢。植入后28天(即共56天），取骨块进行骨形成分析。如μCT所示，与IMO方案相比，ECO方案显著提高了骨密度（BMD）、总骨体积（BV）和骨体积与总体积之比（BV/TV）（图8A）。因此，生态条件下的MSC-mECM结构具有显著较高的杨氏模量（图8A）。
图8与IMO相比，ECO增强了MSC-mECM结构体内骨形成。（A）肌内植入MSC-mECM后异位成骨在OM培养基（IMO）或CM培养基（ECO）中培养4周。μCT图像（顶行）和骨形态测量/材料特性（底行）。数据为平均值±标准差（n=4个生物复制品）。***p0.分，****p0.0.（B）根据培养条件，在第56天（体内植入后28天）采集MSC-mECM结构的组织学和免疫荧光（IF）染色。对于IF，蓝色：细胞核，绿色：靶蛋白。Scalebar?=??μm.（C）根据培养条件，在第56天（体内植入后28天）收获的MSC-mECM构建物的基因表达。数据为平均值±标准差（n=4个生物复制品）。*p0.05分.（D）免疫荧光染色显示人细胞核（红色）和成骨标志物OCN（绿色）共定位。比例尺=50μm
组织学检查时，生态结构显示出更高的矿化度，并表达更高水平的成骨标志物ALP和OCN（图8B）。有趣的是，生态结构还显示了更高水平的CD31，一种内皮细胞标志物，这表明血管内生长更大（图8B）。这一发现与已知的软骨内骨化过程相一致，在这个过程中，新生血管侵入肥大的软骨生成核心，产生能够沉积新基质的成骨祖细胞，帮助现有的软骨细胞转分化为成骨祖细胞[11]。qRT-PCR显示与表达更高水平RUNX2、BSP2和VEGF的ECO结构一致（图8C）。与IMO组相比，ECO组COL1、COL2、ALP和OSX的基因表达也上调，但差异无统计学意义（数据未显示）。最后，人类细胞核特异性抗体和OCN抗体的共同定位表明，在生态条件下构建的人MSCs对骨形成起积极作用（图8D）。
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