前言
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是最常见的骨骼疾病，由于骨质疏松早期没有明显症状，很容易被人们忽视，因此也被称为“隐形杀手”。目前我国OP患者已超过万，居全球之首。然而，目前OP的确切发病机制尚不清楚，阻碍了有效治疗方法的发展。年3月，医院骨科主任兼骨科研究所所长杨惠林教授、骨科耿德春教授团队在Autophagy杂志（IF：16.）在线发表了题为“TET2regulatesosteoclastogenesisbymodulatingautophagyinOVX-inducedboneloss”的研究论文，医院杨晨硕士，陶华强硕士，张海峰博士和夏宇博士为共同第一作者。研究揭示了在OVX小鼠模型中，TET2下调BCL2的表达并增强了BECN1依赖的自噬，从而促进破骨细胞活化和骨量流失，该研究为骨质疏松的治疗提供了新的靶点。文章中的转录组测序服务由欧易生物提供。
研究背景
骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨量减少，骨组织微结构破坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性骨病，多见于绝经后女性和老年男性。绝经后雌激素水平降低，破骨细胞数量增加、凋亡减少、寿命延长，骨吸收功能增强，导致骨量快速流失。鉴于破骨细胞过度活化在骨破坏和骨质疏松症中的重要作用，深入研究破骨细胞活化的机制对于抑制绝经后骨量的快速流失至关重要。
TET2（tetmethylcytosinedioxygenase2）是一种DNA去甲基化酶，也是转录辅助因子，在细胞分化过程中对调节关键基因的转录起重要作用。此外，TET2可以在转录后水平调节基因表达。然而，TET2是否影响绝经后骨质疏松症发展过程中的破骨细胞自噬和分化仍不清楚。
研究结果
OVX诱导自噬并上调破骨细胞中TET2的表达
首先，使用双侧OVX（卵巢切除术）建立雌激素缺乏的骨丢失小鼠模型。为了确定OVX诱导的破骨细胞活化是否与自噬有关，用TNFSF11（肿瘤坏死因子配体超家族成员11）刺激Sham-BMs（骨髓细胞）和OVX-BMs，并测量自噬活性。TEM结果显示，OVX-BMs中产生的自噬体和自溶酶体多于Sham-BMs（图1A）。
内源性LC3B的免疫荧光染色显示相同的结果，并且在OVX-BMs中，自噬体标志物LC3B点的数量增加（图1B，C）。自噬过程中内源性LC3B-I向LC3B-II的转化会增加，因此，通过Westernblot进一步检测了LC3B-II
C3B-I的比率。结果表明，LC3B-IIC3B-I比率在破骨细胞分化过程中增加，并且在OVX-BMs中比在Sham-BMs中更高（图1D，E）。这些结果表明，增强的自噬促进了OVX诱导的小鼠骨丢失中过度的破骨细胞分化。
为了研究TET2是否影响OVX诱导的骨丢失中的破骨细胞分化，通过Westernblot和RT-qPCR测量Sham-BMs和OVX-BMs中的TET2表达。结果表明，TET2在OVX-BMs中的表达更高，并且在破骨细胞分化过程中进一步增加（图1F-H）。以上结果表明TET2对破骨细胞分化和OVX诱导的骨破坏至关重要。
图1
OVX诱导自噬并上调破骨细胞中TET2的表达
TET2对破骨细胞生成过程中自噬的影响
为了研究TET2在破骨细胞分化过程中是否影响自噬，使用LV-sh慢病毒颗粒抑制TET2表达，并评估自噬活性。TEM结果显示，LV-NCBMs在破骨细胞分化过程中自噬体和自溶酶体增加，LV-sh组的自噬体和自溶酶体少于LV-NC组（图2A）。
免疫荧光染色显示LV-sh处理的BMs中LC3B点的数量减少（图2B，C）。在破骨细胞分化过程中，LV-NCBMs的LC3B-IIC3B-I比率会增加，然而敲降降低了LC3B-IIC3B-I的比率（图2D，E）。
此外，研究了TET2抑制对破骨细胞生成的影响，ACP5染色结果显示敲降后ACP5阳性细胞的形成明显减少（图2F，G）。骨吸收测定显示LV-sh组的骨吸收面积减少（图2H，I）。Westernblot显示在敲降Tet2后，破骨细胞标志物MMP9和CTSK的水平降低（图2J，K）。破骨细胞因子和的mRNA水平在敲降后降低了（图2L）。以上结果表明，TET2抑制可以减少自噬并损害TNFSF11诱导的破骨细胞生成和活化。
图2
TET2对破骨细胞生成过程中自噬的影响
敲降改变了破骨细胞的基因表达谱并通过增加BCL2表达来减少自噬囊泡的形成
为了探索TET2调节自噬和破骨细胞分化的潜在分子机制，用TNFSF11处理细胞1或3天后，在敲降的BMs中进行RNA-seq。与对照BMs相比，在敲降的BMs中共鉴定到个（1天）和个（3天）基因表达存在显著差异（P0.05）（FC1.5，且FDR0.05）（图3A、B）。破骨细胞中和等关键基因的表达在LV-sh破骨细胞中显著降低，并且RNA-seq的结果通过RT-qPCR得到了验证。因此，敲降显著抑制了功能性破骨细胞基因的表达。
进一步研究发现，LV-sh干预后，和等功能性自噬基因的mRNA水平没有发生显著变化。Westernblot和RT-qPCR结果证实，BCL2（自噬的负调节因子）的水平在分化过程中的两个时间点（1天和3天）均显著增加（图3C、D)。因此，假设TET2通过BCL2影响破骨细胞自噬并进一步影响破骨细胞功能。
图3
敲降改变了破骨细胞的基因表达谱并通过增加BCL2表达来减少自噬囊泡的形成
干扰BCL2可增强TET2抑制后的自噬和破骨细胞分化
为了研究BCL2对破骨细胞自噬和分化的影响，使用siRNA来降低LV-sh慢病毒颗粒刺激的破骨细胞中BCL2的表达。敲降后，自噬的减少被部分逆转，自噬体、自溶酶体和LC3B点的数量增加（图4A-C）。Westernblot证实了LC3B-II：LC3B-I的比率在siRNA处理组中增加（图4D和E）。这些结果表明降低BCL2表达减轻了TET2抑制诱导的自噬失调。
BCL2与BECN1结合并阻止BECN1促进其他自噬蛋白定位到吞噬细胞组装位点，从而阻止自噬。Co-IP结果表明，抗BCL2抗体可以在LV-NC和LV-shRAW.7细胞中与BECN1结合；此外，更多的BECN1在LV-shRAW.7细胞中被拉下（图4F，G）。抗BECN1抗体与BCL2相互结合，在敲降后相互作用增加（图4H，I）。这些结果表明TET2通过负调节BCL2表达来促进BECN1介导的破骨细胞自噬。
图4
敲降增强了LV-sh转染的BMs中的自噬
此外，探究了BCL2对破骨细胞生成的影响。ACP5染色显示，在LV-shBMs中敲降后，ACP5阳性多核细胞的形成增加（图5A，B）。骨吸收测定表明，敲降后骨吸收面积增加（图5C，D）。Westernblot结果显示，破骨细胞中功能蛋白（MMP9和CTSK）的表达被部分逆转（图5E，F）。在敲降后，和的mRNA水平增加（图5G-J）。综上结果表明，敲降是通过增加BCL2表达和减少BECN1依赖性自噬来减少破骨细胞分化。
图5
敲降增强了LV-shTet2转染的BMs中破骨细胞的分化
敲降TET2可改善OVX小鼠的骨质流失
为了阐明TET2在OVX诱导的骨流失中的作用，用LV-sh慢病毒来抑制OVX小鼠BMs中TET2的表达。3DMicro-CT重构图像表明，OVX小鼠的股骨骨量显著减少。在用LV-sh慢病毒而非LV-NC慢病毒治疗后，骨量的变化部分恢复（图6A）。
此外，骨参数的定量分析表明，与Sham小鼠相比，OVX模型小鼠的骨矿物质密度（BMD）、每组织体积的骨体积（BV/TV）、骨小梁数（Tb.N）和骨体积（BV）减少，骨小梁分离（Tb.sp）增加。在用LV-sh治疗后，逆转了上述变化（图6D-H）。
HE染色用于小鼠股骨组织切片的组织学染色，以进一步评估骨组织微观结构。与LV-NC处理的OVX小鼠相比，LV-sh处理的OVX小鼠骨质疏松表型显著改善（图6B，I）。ACP5染色显示LV-sh显著降低了OVX组的破骨细胞数量（图6C，J）。总之，在OVX模型中验证了干扰TET2表达可显著改善小鼠骨量流失。
图6
敲降可防止体内OVX诱导的骨流失
研究结论
本研究发现TET2通过抑制BCL2表达和正调节BECN1依赖性自噬来促进破骨细胞分化，靶向阻断TET2可降低自噬活性并减轻OVX诱导的骨流失。本研究结果加强了TET2对自噬和破骨细胞分化的表观遗传调控的理解，为阐明破骨细胞的生成机制提供了新基础。
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