卡介苗疫苗是否适合白癜风患者 https://m.39.net/news/a_13287589.html年4月26日，《自然·催化》（NatureCatalysis）以Article形式在线发表了武汉大学药学院刘天罡教授课题组题为“Efficientexplorationofterpenoidbiosyntheticgeneclusterinfilamentousfungi”（丝状真菌萜类生物合成基因簇的高效挖掘）的重磅研究。该研究开发了“基因簇功能元件理性可控重组”策略，实现了萜类沉默基因簇的批量挖掘及高效合成。有效解决困扰该研究领域的“三低”（研究通量低、产物集中度低、产量低）研究瓶颈，显著提升发现新产物的效率。
丝状真菌萜类BGC的高通量挖掘和产物高效合成
该研究借助自动化平台实现了丝状真菌来源萜类基因簇及其产物的高通量挖掘，并开发了真菌高效萜类前体供给底盘，实现了产物的高效合成。在丝状真菌米曲霉（Aspergillusoryzae）底盘中通过模块化组合重构了5种真菌来源的39个I型萜类生物合成基因簇（BiosyntheticGeneCluster，BGC），随后借助抗炎活性高通量筛选模型快速锁定高活性产物及其对应的突变株，紧接着回溯突变株对应的基因簇，解析了具有显著抗炎活性的mangicol类二倍半萜化合物的生物合成机理。随后，进一步开发了米曲霉萜类高产底盘，实现具有显著抗炎活性中间产物mangicolJ的高效合成（图1）。这一工作展示了以“基因簇功能元件理性可控重组”策略为指导，以微生物基因组数据为出发，进行新化合物挖掘、筛选并实现目标产物高效合成的巨大优势。
图1.自动化工作站工作流程
天然产物及其衍生物是药物的重要来源，迄今为止已开发了包括紫杉醇、青蒿素在内的一系列疗效显著的天然产物药物。传统的天然产物直接分离方法常受有限生物样本资源的制约，且经过上百年的研究，随着大量产物被鉴定，发现新产物的难度逐步加大。生物信息学研究结果显示，自然界中尚有海量生物合成基因（簇）有待挖掘。在目前基于基因组信息挖掘过程中，诸多本体宿主在实验室条件下难培养，甚至缺乏完善遗传操作系统。异源表达策略在能满足部分基因（簇）个性化研究的同时，又常受困于底盘适配性问题，致使天然产物挖掘及开发应用饱受“三低”问题困扰。因此，开发高效的天然产物挖掘策略成为突破现有研究瓶颈的关键所在。
为此，刘天罡教授提出“一类钥匙开一类锁”的研究理念，通过利用近源宿主解决同源基因异源表达时适配性差和产量低的问题。该研究以具有结构和生物多样性特征的真菌来源萜类化合物为目标，选用具有合成萜类及其后修饰产物天然优势的丝状真菌米曲霉，作为真菌萜类生物合成基因簇的异源表达宿主。开发“基因簇功能元件理性可控重组”策略，通过批量挖掘功能未知萜类基因簇，并结合生物活性筛选快速锁定高活性产物，最后改造微生物底盘并实现产物高效合成。
首先，该研究对选取五株基因组测序的丝状真菌进行生物信息学分析，通过I型萜类合酶保守结构域DDXXD/E和NSE/DTE，筛选得到含有不同功能基因的39个萜类基因簇（图2）。
图2.39个真菌萜类基因簇异源重构工作流程
为了实现不同真菌来源BGC基因在A.oryzae中的可控高效异源表达，该研究表征了一系列不同强度的启动子。基于“基因簇功能元件理性可控重组”策略，通过基因簇的化整为零以及各功能元件理性可控重组，将每个基因簇重建为一个小型突变株库。借助自动化高通量操作平台（Auto-HTP工作站），将39个BGC中的功能基因、强启动子和终止子组装成完整的表达框，构成含有萜类BGC不同模块基因的质粒库。通过在A.oryzae中异源表达，从而构成能够充分展示产物丰富度且能阐明或推测生物合成途径的菌株库，突破了人力资源瓶颈的制约，解决了研究通量低的问题。
在此过程中，Auto-HTP工作站经过两轮自动化构建，实现批量扩增个片段、构建个质粒和个A.oryzae突变株的成功率分别达到98%、96%和96%，将突变株构建周期缩短至17天，充分证明了该自动化平台的高效性。
随后，分别通过气质色谱（GC-MS）和高分辨液相色谱（HR-ESI-MS）对个工程菌株进行产物检测。结果显示，个突变株产生个倍半萜、59个二萜和23个二倍半萜共计个萜类化合物。其中萜类骨架化合物62个，后修饰产物个（图2），构建了一个具有丰富产物结构的萜类化合物库，有效解决了产物集中度低的问题，也为高活性产物的筛选铺平了道路。
为评估化合物库中产物结构多样性，该研究随机选择了4个基因簇BGC3，BGC4，BGC25和BGC27，鉴定其产生化合物6，35，和的结构，分别将其命名为3,11-eudesmadien-2-one，traversiadiene，(+)-germacrenol和(-)-aristolochene。其中，化合物35（traversiadiene）是具有杀软体动物活性二萜traversianal的前体化合物，与BGC4-AaT相关的突变株重构，为进一步阐述该基因簇生物合成机理奠定了坚实的基础。该结果也充分说明，本研究得到的萜类化合物库，结构较为丰富，可用于多种类活性筛选。研究表明，BGC6中萜类环化酶FgJ负责guaia-6,10(14)-diene的合成，该化合物可经7步高效的化学催化反应，半合成得到具有显著抗肾癌活性的倍半萜(-)-englerinA。为了明确该基因簇是否具备直接合成植物来源的(-)-englerinA的潜力，该研究进一步对BGC6重构的A.oryzae突变株中化合物进行了分离、纯化，最终鉴定了2个新的后修饰产物。在推进该基因簇生物合成机理解析的同时，也为(-)-englerinA的生物合成途径研究提供了新思路（图3）。同时，能够为(-)-englerinA的化学半合成提供更多可选的前体化合物，从而使有效降低(-)-englerinA的合成成本成为可能。
图3.BGC-FgJ中englerinA生物合成途径推测
炎症是机体受到某类刺激时，发生的一种以防御反应为主的免疫反应。研究表明，过度的炎症反应与糖尿病、心血管疾病、神经性疾病和癌症等疾病密切相关。严重的全身感染还会引发败血症，甚至导致休克。目前COVID-19肆虐全球，患者出现“炎症风暴”时，临床常用糖皮质激素类抗炎药容易带来血压增高、虚胖和骨质疏松等副作用。面对临床急需更优选抗炎药物这一需求，本研究以构建的萜类产物库为基础开展抗炎活性筛选研究。
该研究以磷酸脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞作为炎症模型，以对炎症因子一氧化氮（NO）的抑制率为检测指标，对A.oryzae工程菌株发酵粗提物进行高通量活性筛选，最后将研究目标锁定到二倍半萜基因簇BGC11-FgMS。随后研究者回溯BGC11-FgMS基因簇对应的突变株，分离、纯化并鉴定与该基因簇相关的萜类产物，并进一步系统评估分离鉴定的一系列mangicol类新产物（mangicolH-L）的抗炎活性。结果显示，在浓度为μM时，其均未表现出明显的细胞毒性。随后，基于NO炎症抑制实验，本研究进一步筛选到相比于市售消炎药吲哚美辛抗炎活性效果更为显著的mangicolJ。然后，该研究进一步展开了小鼠体内抗炎活性筛选。佛波酯和磷酸脂多糖分别诱导的小鼠中耳炎和全身炎症模型结果进一步表明，mangicolJ展现出与吲哚美辛相当甚至更好的抗炎活性，同时还可以显著降低小鼠体内IL-6和TNF-α等关键炎症因子的含量（图4）。基于此，该研究还进一步对mangicolJ活性作用机理进行初探，对IL-6下游的JAK2-STAT3炎症信号通路的研究表明，mangicolJ可以有效降低磷酸化STAT3蛋白的作用，且随着作用时间加长，作用效果也更为显著。总的来说，该研究筛选到了一个具有高效抗炎活性且低毒的二倍半萜mangicolJ，在充分证明该化合物极具进一步开发价值的同时，也为mangicolJ进行更深入的抗炎活性研究，提供了充足的前期数据。
图4.高通量抗炎活性筛选和FgMS基因簇产物活性研究
随后，本研究结合前期可充分展示萜类BGC生物合成能力的批量突变株发酵检测数据，快速解析出基因簇合成mangicols化合物的生物合成机制，同时鉴定出一个能够催化多步氧化反应的关键双功能酶mgcE（图5）。
图5.BGC-FgMS中mangicols产物生物合成途径解析
为能够提供充足的mangicolJ，来进一步完善其抗炎活性、毒性和机理研究。该研究继续以高效合成活性化合物mangicolJ为目标，基于质粒多拷贝随机插入和基因高表达位点同源重组两种模式，开展并实现了丝状真菌宿主内MVA途径代谢通量加强的萜类代谢工程改造。
首先，为了快速评估A.oryzae宿主中加强MVA途径代谢通量实现萜类高效合成的潜力，该研究以质粒转化A.oryzae宿主中，基因多拷贝随机插入的方式，基于强启动子过表达了整个MVA途径、mgcD以及额外3个拷贝的限速步骤tHMG1基因，菌株AO-S84实现了萜类骨架mangicdiene产量为87.84mg/L高效合成，较出发菌株提升了约倍。随后，又分别过表达1个、2个拷贝的mgcE基因，菌株AO-S93、AO-S94分别积累了9.14mg/L和12.09mg/L的mangicolJ，较出发菌株产量分别提升了约和倍。
在可实现A.oryzae中抗炎萜类高效合成基础上，该研究又以稳定且高效地挖掘和合成萜类化合物为目标，来搭建A.oryzae通用型萜类高产底盘。为实现可基于多筛选标记灵活运用该底盘，该研究借助CRISPR/Cas9技术敲除pyrG基因，基于5-氟乳清酸反筛体系，开发筛选标记可循环使用的多步骤遗传改造策略，来加强MVA途径代谢通量。通过系统地评估并优化在丝状真菌宿主中常用的CRISPR/Cas9系统，成功实现了基于真菌复制元件AMA1序列和多个sgRNA靶向目标基因的CRISPR/Cas9介导的高效同源重组，将14kb基因整合到基因组特点位点的效率高达87.5%。
在实现CRISPR/Cas9介导的筛选标记可重复使用的高效率同源重组后，该研究又将MVA途径、mgcD和限速步骤tHMG1基因在基因高表达位点进行加强表达，菌株AO-S96中积累了27.39mg/L的mangicdiene。通过进一步整合型过表达1个、2个拷贝的mgcE，菌株AO-S97、AO-S98分别积累了7.26mg/L和8.93mg/L的mangicolJ，较出发菌株产量分别提升了约91和倍。同时，还搭建了两个通用且高效的丝状真菌A.oryzae萜类高产底盘菌株AO-S85（基因多拷贝随机插入型）和AO-S95（基因高表达位点同源重组型），以便于其他真菌来源萜类化合物的快速挖掘和高效合成（图6）。
图6.搭建A.oryzae萜类高产底盘实现mangicolJ高效合成
该研究开发的“基因簇功能元件理性可控重组”策略，全面覆盖了基因簇挖掘——活性筛选——产物高效合成上中下游研发流程。在实现萜类BGC基因模块化高通量异源重构，拓展并丰富化合物种类的同时，还可快速阐明该类化合物的生物合成途径，挖掘并高效合成传统天然产物挖掘方式容易忽略却又极具应用价值的活性中间产物，为萜类天然产物挖掘提供了一个高效解决方案，也为其他类型天然产物基于基因组信息的批量挖掘提供了研究思路（图7）。
图7.基于近源高效微生物底盘的萜类基因组信息高通量挖掘
这是刘天罡教授提出基于“高效底盘用于萜类化合物高通量挖掘”理念以来，连续在《MetabolicEngineering》（代谢工程）、《CurrentOpinioninBiotechnology》（生物技术新观点）、《AngewandteChemieInternationalEdition》（德国应用化学）、《JournalofAmericanChemicalSociety》（美国化学学报）、《NatureCommunications》（自然通讯）和《ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica》（美国科学院院报）等国际著名刊物发表萜类产物挖掘以及产物合成机理研究工作，进一步在该领域取得的又一突破性进展。
本论文以武汉大学为唯一署名单位，苑玉杰博士、博士研究生程术和卞光凯研究员为共同第一作者，刘天罡教授为唯一通讯作者。
该研究工作得到科技部合成生物学国家重点研发计划，国家自然科学基金及武汉大学医学科学进步计划等项目资助。
刘天罡课题组网站：
